循环肿瘤DNA检测研究概况与产品审评思考

应用前景广阔 技术有待升级 产品评估严格

肿瘤液体活检的检测靶标主要包括循环肿瘤DNA（ct DNA）、循环肿瘤细胞（CTC）和外泌体等。其中，ctDNA基础研究近年来取得了较大进展，相关检测试剂相继获批上市。然而，该检测靶标在临床应用中仍有诸多技术问题尚待攻克。本文介绍ct DNA的生物学特性和研究进展，分析其检测应用面临的技术挑战，并概述对相关检测试剂的审评思考。
临床应用前景可期
在生理或病理状态下，细胞发生坏死或凋亡时，细胞核内或线粒体内的DNA会释放到血液、胸腔积液、脑脊液、尿液和痰液等体液中。循环游离DNA（cfDNA）是细胞外DNA的降解产物，片段大小约为150bp~200bp。健康人体的cfDNA浓度通常低于100μg/L，平均约为30μg/L;而中晚期肿瘤患者体内cf DNA浓度可高达1000μg/L，平均约为180μg/L。
ctDNA是cfDNA家族中的一类，来源于肿瘤细胞，主要由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，可反映肿瘤的异质性。目前，关于ctDNA释放的确切机制尚不明确。在健康人体中，ctDNA的水平很低；而对于肿瘤患者，可检测到较高水平的ctDNA，且其体内的ctDNA比例与肿瘤负荷呈正相关。ctDNA在cfDNA中的占比较低，中晚期肿瘤患者体内该比例约为8%~10%；在肿瘤早期或治疗缓解后，该比例低至0.01%~1.7%。此外，血液中ctDNA半衰期为15分钟至数小时。
ctDNA的水平可反映患者体内肿瘤的全景数据，能够全面反映与肿瘤组织相同的突变基因组信息（包含突变、缺失、插入、重排、拷贝数异常以及甲基化等相关突变信息）。此外，有研究表明，通过检测患者体内ctDNA的水平，可获取肿瘤的相关踪迹信息。由此可见，ctDNA检测在肿瘤筛查、早期诊断、微小残留病灶和复发监测、疗效评价、指导靶向药物使用以及生存评估等领域均具有良好的临床应用前景。需要关注的是，目前ctDNA尚处于小范围研究阶段，不同研究文献得到的结果存在差异，因此仍需要开展大量的实验和详细的数据分析，方可充分验证ct DNA作为肿瘤临床生物标志物的可靠性。
技术瓶颈有待突破
低丰度ctDNA对于检测技术的灵敏度要求很高。目前，在该领域基础研究中，常用的检测技术包括突变扩增阻滞系统（ARMS）、数字PCR（dPCR）以及新一代测序（NGS）等，各种方法的检测原理、灵敏度、特异性和通量等各不相同。对于ARMS和dPCR技术，不同方法间的检测差异与样本处理、提取效率、引物位置和探针修饰等有关；对于NGS技术，检测灵敏度除了与样本处理有关以外，还与每一步反应的效率和测序深度有关。

当前，尽管ctDNA可作为一种较为理想的肿瘤液体活检检测靶标，但其在实际检测应用中仍存在许多技术问题，包括样本处理、检测的标准化、灵敏度、特异性、阳性预测值和临床适用性等。例如，针对不同种类及不同时期的肿瘤，目前尚无样本采集、ctDNA提取以及扩增的标准流程。再例如，体液中ctDNA会被巨噬细胞实时清除，从而导致体液内含量极低，但目前大多数ctDNA研究集中于具有相对高浓度ctDNA的晚期癌症，而缺乏对于具有相对低浓度ctDNA的早期癌症的详细检测经验。此外，ctDNA检测有时会出现一定程度的假阴性或假阳性，主要原因是肿瘤具有异质性，即原发肿瘤、转移性肿瘤、ctDNA三者之间存在差异。并且，由于肿瘤组织和ctDNA的检测标准不一致，不同研究给出的一致性数据差异通常较大。

目前，全球已获批上市的ctDNA检测试剂主要分为两大类。一类是用于检测血浆等体液中特定基因的甲基化，用于特定肿瘤的辅助诊断或筛查。例如，国家药监局（NMPA）和美国食品药品管理局（FDA）相继批准了血浆SEPT9基因甲基化检测试剂，该试剂用于特定人群结直肠癌辅助诊断。此外，NMPA目前已批准了肺泡灌洗液中SHOX2、RASSF1A基因甲基化检测相关产品，用于肺癌的辅助诊断等。需要关注的是，已获批的ctDNA甲基化检测试剂均是基于荧光定量PCR方法的产品，但该方法的检测灵敏度有限。

另一类已获批上市的ctDNA检测试剂是用于检测血浆中特定基因突变情况的产品，用于特定药物的伴随诊断。例如，FDA和NMPA相继批准了血浆中EGFR基因突变检测试剂，用于奥希替尼等抗肿瘤药物的伴随诊断，该类检测试剂同样为基于荧光定量PCR方法的产品，其检测灵敏度也有待提高。此外，FDA于2020年批准了Guardant Health公司的Guardant360 CDx血浆ctDNA检测试剂，用于识别表皮生长因子受体（EGFR）基因突变的转移性非小细胞肺癌（NSCLC）患者，这些患者可能会受益于奥希替尼治疗。值得关注的是，这是FDA批准的首个将NGS技术和液体活检技术相结合、指导临床治疗决策的诊断检测产品。

临床价值仍需深入挖掘
在ctDNA检测试剂注册审评方面，针对用于辅助诊断的DNA甲基化检测试剂，重点关注ctDNA检测的临床意义，尤其应关注特定甲基化基因的临床使用价值。目前，肿瘤基因甲基化是一大研究热点，对于不同癌种，往往会出现多种不同的甲基化基因。在考虑某个甲基化基因是否具有临床转化应用价值时，建议全面调研该甲基化基因的所有相关临床研究资料，系统评价相关临床研究设计是否科学、病例是否充分，得出的结论是否科学可信等。需要注意的是，在肿瘤发展早期，由于体液中的ctDNA含量较低，甲基化检测的灵敏度较低，可能无法满足临床使用需求。

针对用于伴随诊断的产品，重点关注血浆ctDNA检测的适用性。有研究表明，血浆ctDNA中的基因突变检测结果与肿瘤组织中的基因突变检测结果存在较大差异，因此，肿瘤组织基因检测依然是目前肿瘤靶向治疗的公认标准。NMPA批准的抗肿瘤药物吉非替尼，其说明书要求，晚期NSCLC患者在治疗前应检测组织EGFR突变情况，但由于肿瘤组织不可评估，可检测血液标本中ctDNA的水平并进行评估，以鉴别出最可能从吉非替尼治疗中受益的NSCLC患者。2015年，《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》同样提出，当难以获取肿瘤组织时，可将血液EGFR基因突变检测作为合适替代，作为对可疑组织检测结果的补充。此外，NMPA批准的ctDNA伴随诊断试剂也强调了上述要求。

需要关注的是，对于血浆ctDNA肿瘤基因突变检测与肿瘤组织基因突变检测结果差异较大的癌种，应综合考虑临床应用风险，慎重考虑将血浆ctDNA检测试剂作为伴随诊断试剂的可行性。对于哪些肿瘤患者的血浆ctDNA可作为组织基因检测的替代，仍需要进行深入研究，不可盲目申报。

此外，美国临床肿瘤学会（ASCO）和美国病理学家协会（CAP）于2018年联合发表的评估报告显示，目前，ctDNA在肿瘤早期诊断、微小病变残留检测以及疗效监测领域的有效性和实用性证据依然不足，除了经过法规审批的、经严格验证的ctDNA检测可用于指导靶向治疗外，大多数ctDNA检测仍需要大量实验结果和临床试验数据支撑，现阶段不宜在临床广泛开展，后续研究应尽可能纳入预期适用人群，通过严格设计的临床研究来充分验证其临床意义。

（摘自中国医药报）

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